Настоящая Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности разработана Всесоюзным научно-исследовательским и конструкторским институтом молочной промышленности, НПО "Углич" и при участии лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии Института питания АМН СССР.

Основной задачей микробиологического контроля в молочной промышленности является обеспечение выпуска продукции высокого качества, повышение ее вкусовых и питательных достоинств.

Микробиологический контроль на предприятиях молочной промышленности заключается в проверке качества поступающих молока, сливок, материалов, закваски, готовой продукции, а также за соблюдением технологических и санитарно-гигиенических режимов производства.

При контроле качества сырья необходимо обращать внимание на его общую бактериальную обсемененность и при производстве сыра - на содержание спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий, при контроле эффективности пастеризации - на содержание бактерий группы кишечных палочек (БГКП), при контроле заквасок - на их микробиологическую чистоту и активность.

В целях обеспечения выпуска продукции в строгом соответствии с требованиями нормативно-технической документации (ГОСТ, ОСТ, ТУ и др.) большое внимание должно уделяться контролю качества готовой продукции и в случаях его ухудшения - контролю технологических режимов производства с целью определения мест и интенсивности микробиологического обсеменения технически вредной микрофлорой.

Результаты микробиологического исследования качества готовой продукции, в отличие от результатов физико-химического исследования, из-за длительности анализов не могут быть использованы для задержки выпуска цельномолочной продукции, но по ним оценивают санитарно-гигиеническое благополучие предприятия, судят о правильности течения микробиологических процессов в технологии производства молочных продуктов, деятельности полезных микроорганизмов и микробиологических причинах появления пороков продукции.

В целях улучшения санитарно-гигиенического и технологического режимов на предприятиях микробиологическую оценку качества готовой продукции, мойки и дезинфекции технологического оборудования, а также личной гигиены следует включать в оценку качества труда цехового персонала при выплате премиальных доплат.

При организации микробиологического контроля следует руководствоваться настоящей Инструкцией по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности, а также нормативно-технической документацией на сырье, молочную продукцию, технологическими инструкциями, санитарными правилами, инструкцией по мойке и дезинфекции технологического оборудования, утвержденными положениями об ОТК (лаборатории), микробиологах городских молочных, молочно-консервных и маслодельно-сыродельных заводов и комбинатов.

Настоящая Инструкция касается микробиологического контроля сырого молока, сливок, готовой продукции предприятий молочной промышленности (за исключением мороженого), используемых в производстве вспомогательных материалов, контроля по ходу технологического процесса, а также контроля санитарно-гигиенического состояния производства и воздуха рабочих помещений.

Посевы производят в боксе. Бокс комплектуется из двух отделений, собственно бокса и предбоксника. Предбоксник служит для одевания специальной санитарной одежды (халаты, колпаки или косынки) и вспомогательных работ. Бокс должен быть оборудован бактерицидными лампами (БуВ-30 и др.), количество которых определяют из расчета мощности облучения 2,5 Вт на куб. м. Выключатель к бактерицидным лампам устанавливается на наружной поверхности бокса. Бактерицидные лампы включаются по окончании работы и уборки помещения, в отсутствие персонала, на 30 - 60 мин.

При определении редуктазной пробы, а также при отсутствии специального бокса допускается проведение анализов в лабораторной комнате, в которой во время анализа должны быть закрыты форточки и дверь во избежание движения воздуха.

Ежедневно после окончания работ помещение боксов моют горячей водой с мылом или порошком и протирают досуха.

1 раз в неделю проводят дезинфекцию помещений протиранием всех поверхностей дезинфицирующими препаратами по соответствующей для каждого препарата инструкции.

1.2.1. Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной долей 1 - 2%) в течение 15 мин. и затем ополаскивают дистиллированной водой.

Посуда с питательными средами после подсчета на них кишечных палочек, дрожжей, плесеней и маслянокислых бактерий обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °C в течение 30 мин. или кипячением в течение 1 ч.

1.2.2. Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160 +/- 5) °C в течение 2 ч или в автоклаве при (121 +/- 1) °C в течение (30 +/- 1) мин. с последующим подсушиванием. Перевод давления, показываемого манометром автоклава, в температуру проводится следующим образом:

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Резиновые пробки стерилизуют в автоклаве завернутыми в бумагу.

При отсутствии аппаратуры для стерилизации посуду, пипетки и пробки (для определения редуктазы, бродильной и сычужно-бродильной проб) непосредственно перед испытанием кипятят в дистиллированной воде или конденсате не менее 30 мин.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

Срок хранения стерильной посуды не более 30 суток.

1.2.3. Изготовленные ватные или марлевые тампоны стерилизуют каждый в отдельности завернутыми в бумагу. Отдельно стерилизуют пробирки с 4 куб. см раствора хлористого натрия при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

Тампон может быть закреплен на проволоке или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку. В этом случае его вместе с пробкой вставляют в пробирку с 4 куб. см раствора хлористого натрия или 5 куб. см среды Кесслер (тампон не должен касаться раствора) и все вместе стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

1.2.4. Температура внутри автоклава и давление связаны жесткой зависимостью. Поэтому для контроля работы необходимо и достаточно иметь поверенный в территориальных органах Госстандарта манометр, класса не выше 1,5, который должен ежегодно проходить поверку в органах Госстандарта. Ежеквартально работа манометров должна проверяться метрологической службой предприятия с соответствующей регистрацией результатов проверки.

1.3.1. Приготовление раствора хлористого натрия.

В 1000 куб. см питьевой воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор по 10 куб. см в чистые пробирки диаметром 21 мм, а в колбы - по 93 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин. После стерилизации в пробирках остается обычно 9 куб. см раствора хлористого натрия, а в колбах - по 90 куб. см (количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала).

1.3.2. Приготовление концентрированного раствора фосфатного буфера.

В 500 куб. см дистиллированной воды растворяют 34 г однозамещенного фосфорнокислого калия. Устанавливают pH 7,2 20-процентным раствором гидроокиси натрия и добавляют дистиллированной воды в мерную колбу до 1000 куб. см.

1.3.3. Приготовление разбавленного раствора фосфатного буфера.

1,25 куб. см концентрированного раствора фосфатного буфера вносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, доводят объем до метки дистиллированной водой, разливают в пробирки по 10 куб. см и колбы по 93 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин., и используют для приготовления разведений.

1.3.4. Приготовление раствора лимоннокислого натрия для приготовления разведений сыра.

В 1000 куб. см дистиллированной воды растворяют 20 г трехзамещенного лимоннокислого натрия, разливают в пробирки по 10 куб. см и колбы по 93 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

1.3.5. Приготовление раствора двузамещенного фосфорнокислого калия для приготовления разведений казеина для пищевых казеинатов.

В 1000 куб. см дистиллированной воды растворяют 20 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Устанавливают активную кислотность 8,4 ЕД pH (для приготовления разведения 1:10) и 7,4 (для приготовления всех последующих разведений). Разливают в пробирки по 10 куб. см и колбы по 93 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

1.3.6. Приготовление раствора двууглекислого натрия для нейтрализации проб кисломолочных продуктов и закваски.

В 100 куб. см дистиллированной воды растворяют 10 г двууглекислого натрия, разливают по 10 - 20 куб. см в пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

1.3.7. Приготовление стерильной дистиллированной воды.

Дистиллированную воду разливают в колбы по 600 куб. см или пробирки по 10 куб. см и стерилизуют (20 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) °C.

1.4.1. Приготовление реактивов для окраски по Граму (модификация Г.П. Калины).

1.4.1.1. Приготовление реактива 1.

В 100 куб. см этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.

1.4.1.2. Приготовление реактива 2.

К 96 куб. см спиртового раствора йодистого калия с массовой концентрацией 5 г/куб. дм добавляют 2 куб. см спиртового раствора основного фуксина с массовой концентрацией 50 г/куб. дм и 2 куб. см спиртового раствора йода с массовой концентрацией 50 г/куб. дм.

Йодистый калий растворяют в спирте в водяной бане при температуре (45 +/- 5) °C при постоянном помешивании.

1.4.2. Приготовление реактивов из метиленового голубого.

1.4.2.1. Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого.

10 г метиленового голубого смешивают со 100 куб. см 96-процентного раствора этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 24 ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре.

Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температура (37 +/- 1) °C - не более 3 мес.

1.4.2.2. Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре (45 +/- 1) °C на 5 - 10 мин., перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20 + /- 1) °C и 5 куб. см этого раствора прибавляют к 195 куб. см дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7 сут. при температуре 8 - 10 °C.

1.4.2.3. Приготовление водного раствора метиленового голубого с массовой долей метиленового голубого 0,5% (для определения ингибирующих веществ ГОСТ 13264-79).

500 мг метиленового голубого помещают в колбу, доливают 100 куб. см дистиллированной кипяченой воды, перемешивают до полного растворения, плотно укупоривают и хранят в холодильнике при 6 - 8 °C не более 30 сут.

1.4.3. Приготовление раствора резазурина.

Основной раствор резазурино-натриевой соли для редуктазной пробы готовят следующим образом: 100 мг резазурино-натриевой соли переносят в мерную колбу вместимостью 200 куб. см и доводят до метки прокипяченной и охлажденной до (25 +/- 2) °C дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения основного раствора резазурино-натриевой соли - не более 30 сут. при температуре 8 - 10 °C.

Основной раствор резазурино-натриевой соли используется для определения ингибирующих веществ.

Рабочий раствор резазурино-натриевой соли готовят разбавлением основного раствора прокипяченной и охлажденной (25 +/- 2) °C дистиллированной водой в соотношении 1:25 (например, к 10 куб. см основного раствора прибавляют 25 куб. см воды). Массовая доля резазурина в рабочем растворе 0,014%.

При использовании резазурина в таблетках (производства ГДР) для приготовления рабочего раствора 1 таблетку растворяют в 50 куб. см прокипяченной и охлажденной до (25 +/- 2) °C дистиллированной воды. Массовая доля резазурина в этом растворе 0,01%.

Срок хранения рабочего раствора резазурина - не более 3 сут. при температуре 0 - 5 °C.

Основной и рабочий растворы хранят в банках, защищенных от света.

1.4.4. Приготовление раствора сычужного фермента.

0,5 г сычужного порошка растворяют в 100 куб. см воды, нагретой до (30 +/- 1) °C.

1.4.5. Приготовление водного раствора пептона с массовой долей пептона 3%.

3 г пептона помещают в колбу и доливают до 100 куб. см питьевой водой, стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин. и хранят в холодильнике при 6 - 8 °C в течение 30 сут. В случае отсутствия автоклава допускается кипячение раствора пептона в течение 1 - 2 мин. на слабом огне. Данный раствор должен быть использован в течение 7 - 8 ч.

1.4.6. Приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов.

К 30 куб. см основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды и 1 куб. см раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/куб. дм.

1.4.7. Приготовление раствора карболового кристаллического фиолетового для окраски препаратов.

1 г красителя кристаллического фиолетового растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 куб. см 96-процентного раствора этилового спирта. Окончательно разводят до 100 куб. см дистиллированной водой. Таким образом получают основной раствор для приготовления рабочего раствора.

К 10 куб. см основного карболового раствора кристаллического фиолетового добавляют 20 куб. см дистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

Раствор хранить в темном флаконе под притертой пробкой.

Водные растворы антибиотиков готовят непосредственно перед использованием.

1.5.1. Приготовление раствора пенициллина.

Во флакон с пенициллином, содержащим 500000 ЕД/куб. см добавляют от 5 до 7 куб. см стерильной дистиллированной воды (п. 1.3.7), тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки стерильной дистиллированной водой при температуре от 35 до 40 °C. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ЕД/куб. см.

При использовании пенициллина другой активности делают соответствующий пересчет.

1.5.2. Приготовление раствора стрептомицина.

400 мг стрептомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют от 10 до 20 куб. см стерильной дистиллированной воды (п. 1.3.7) при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация стрептомицина в растворе - 4,0 г/куб. дм.

1.5.3. Приготовление раствора неомицина.

500 мг неомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют от 10 до 20 куб. см стерильной дистиллированной воды (п. 1.3.7) при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация неомицина в растворе - 5,0 г/куб. дм.

1.5.4. Приготовление раствора левомицетина (хлорамфеникол).

400 мг левомицетина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют от 10 до 20 куб. см стерильной дистиллированной воды (п. 1.3.7) при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация левомицетина в растворе - 4,0 г/куб. дм.

1.5.5. Приготовление раствора неомицина (для учета бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах).

(0,5 + 0,01) г неомицина (сульфата или основания) растворяют в (500 +/- 1) куб. см стерильной дистиллированной воды.

В случае таблетированной формы неомицина его предварительно тщательно растирают в профламбированной ступке, а раствор неомицина дополнительно кипятят в течение 2 - 3 мин.

1.5.6. Водные растворы антибиотиков добавляют к расплавленной и охлажденной до (46 +/- 1) °C питательной среде.

1.6.1. Приготовление питательной среды для определения общего количества бактерий (мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов) (по ГОСТ 9225-84).

40 г сухой питательной среды, выпускаемой ВНИИКИМ, помещают в колбу и доливают питьевой водой до 1000 куб. см. Смесь перемешивают, нагревают до полного растворения агара (при наличии осадка профильтровывают), устанавливают pH 6,8 - 7,0. Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

1.6.2. Питательные среды для определения бактерий группы кишечных палочек (БГКП).

1.6.2.1. Приготовление среды Кесслер (модифицированной) (ГОСТ 9225-84).

16 г сухой среды Кесслер помещают в колбу и доливают питьевой водой до 1000 куб. см. Смесь размешивают и кипятят при помешивании (25 +/- 5) мин. Объем доводят питьевой водой до 1000 куб. см и фильтруют через вату. Разливают в пробирки с поплавками по 5 куб. см или колбочки с поплавками по 40 - 50 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин.

Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Допускается приготовление среды Кесслер из отдельных ингредиентов.

Для этого к 1000 куб. см питьевой воды прибавляют 10 г пептона и 50 куб. см стерильной желчи (желчь бычья или других сельскохозяйственных животных), кипятят смесь при помешивании (25 +/- 5) мин. и фильтруют ее через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и доводят объем питьевой водой до 1000 куб. см, устанавливают активную кислотность 7,4 - 7,6 ЕД pH, после чего добавляют 2 куб. см раствора кристаллического фиолетового с массовой концентрацией 10 г/куб. дм, разливают в пробирки с поплавками или колбочки с поплавками по 40 - 50 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

1.6.2.2. Приготовление плотной среды Кесслер.

К 1000 куб. см жидкой среды Кесслер добавляют 8 г агара, среду кипятят на слабом огне до полного расплавления агара, а затем фильтруют. Расплавленную среду разливают по 7 - 8 куб. см по пробиркам и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин.

1.6.2.3. Агар желчный фиолетово-красный - плотная среда для микробиологического контроля сычужных сыров.

К 1000 куб. см гидролизованного молока (п. 1.6.7.2) добавляют 30 куб. см дрожжевого автолизата (п. 1.6.4.6), 15 куб. см желчи, 0,03 г нейтрального красного, 0,004 г кристаллического фиолетового и 15 г агар-агара. Среду кипятят 5 мин. при перемешивании. Устанавливают активную кислотность, добавляя 20-процентный водный раствор едкого натрия, 7,2 - 7,4 ЕД pH и разливают в пробирки по 10 - 12 куб. см или флаконы (50 - 100 куб. см). Среду готовят непосредственно перед посевом.

Допускается применение среды, прокипяченной 30 мин. в водяной бане или пастеризованной текучим паром 30 мин. в автоклаве, в течение 3 суток.

Готовая среда должна иметь фиолетово-красный цвет.

Примечание. Может быть использован агар желчный фиолетово-красный, сухой, который готовят по прописи, прилагаемой к каждой партии среды: 3,5 г порошка всыпать в 100 куб. см холодной дистиллированной воды, тщательно размешать, кипятить при помешивании 5 мин. Разлить в пробирки или флаконы.

1.6.3. Питательные среды для определения дрожжей и плесневых грибов (по ГОСТ 26888-86).

1.6.3.1. Приготовление среды из сухого сывороточного агара БФ.

К 1000 куб. см дистиллированной воды прибавляют 60 г сухого агара сывороточного БФ, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют).

Активную кислотность (4,0 - 4,5) ЕД pH устанавливают с помощью молочной кислоты, разливают в мерные колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (15 + /- 1) мин.

1.6.3.2. Приготовление среды Сабуро.

К 1000 куб. см дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин. для его набухания, затем добавляют 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают активную кислотность (6,5 +/- 0,1) ЕД pH с помощью молочной кислоты, разливают в мерные колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

1.6.3.3. Приготовление раствора солодового сусла с массовой долей сухих веществ (7,5 +/- 0,5)%.

Сусло фильтруют через фильтровальную бумагу, разливают в колбы и стерилизуют (30 +/- 1) мин. при (108 +/- 2) °C. Затем сусло декантируют.

Массовую долю сухих веществ в сусле определяют ареометром-сахаромером. Сусло разбавляют водой до массовой доли сухих веществ (7,5 +/- 0,5)%, разливают в колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C (20 +/- 1) мин.

Допускается использовать виноградное сусло, которое готовится аналогично солодовому.

1.6.3.4. Приготовление солодового агара.

К 1000 куб. см сусла массовой долей сухих веществ (7,5 +/- 0,5)% прибавляют 30 г агара. Среду нагревают до полного расплавления агара и фильтруют через вату или фильтровальную бумагу. Охлаждают до (50 +/- 5) °C и устанавливают активную кислотность (3,6 +/- 0,1) ЕД pH с помощью молочной кислоты. Фильтрат разливают в мерные колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

1.6.3.5. Для повышения селективности сывороточного агара БФ и среды Сабуро добавляют антибиотики в объеме, указанном в таблице 1. Антибиотики готовят согласно пункту 1.5.

Водные растворы антибиотиков вносят перед использованием в расплавленную и охлажденную (до 46 +/- 1) °C питательную среду.

1.6.4. Среды для определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий (ГОСТ 25102-82).

1.6.4.1. Молочная среда для определения общего количества споровых анаэробных бактерий.

По 5 куб. см цельного или обезжиренного молока разливают в пробирки (пробирки с 1 - 1,5 г парафина должны быть стерильными) и затем стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 мин. Для обогащения среды к молоку до стерилизации можно добавить 0,5 - 1,0 г глюкозы и 0,05 - 0,08% цистеина.

1.6.4.2. Приготовление питательной среды для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий (СДА).

К 1 куб. дм дистиллированной воды добавляют (40 +/- 0,5) г сухой питательной среды для определения споровых анаэробных бактерий. Смесь перемешивают, нагревают до полного растворения агара (при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр), устанавливают pH 7,0 - 7,2. Разливают в пробирки по (13 +/- 2) куб. см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Допускается приготовление среды для определения спор мезофильных анаэробных бактерий из отдельных ингредиентов. Для этого в 1 куб. дм гидролизованного молока вносят (15 +/- 1) г микробиологического агара, (0,5 +/- 0,1) г солянокислого цистеина, (1 +/- 0,1) г растворимого крахмала и (5 +/- 0,1) г уксуснокислого натрия. Растворяют добавленные компоненты, нагревая смесь в текучем пару. Добавляют (5 +/- 0,1) г глюкозы и 20 куб. см дрожжевого автолизата. Устанавливают pH (7,0 +/- 0,2), разливают среду в пробирки по (13 +/- 2) куб. см, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (115 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

При длительном хранении среды (более 20 суток), после охлаждения пробирок со средой ватные пробирки в стерильных условиях заменяют на стерильные резиновые.

Приготовленную среду хранят в темном месте при температуре (8 +/- 2) °C не более 3-х месяцев.

Примечания: 1. Допускается замена солянокислого цистеина аскорбиновой кислотой в количестве 1 г.

2. Вместо дрожжевого автолизата, приготовленного по п. 1.6.4.6, допускается использовать 4 г сухого дрожжевого автолизата.

1.6.4.3. Приготовление питательной среды для определения количества спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий.

К 1 куб. дм питьевой воды добавляют (50 +/- 0,5) г сухой лактатно-ацетатной среды для селективного учета анаэробов ("Ласса-Углич").

Смесь перемешивают, нагревают до полного растворения агара и кипятят 3 - 5 минут, не допуская пригорания. Полученную среду в горячем состоянии фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают pH 5,7 +/- 0,05, разливают в пробирки по (15 +/- 2) куб. см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Готовая среда должна иметь интенсивно-розовый или красный цвет.

Допускается приготовление лактазно-ацетатной среды из отдельных ингредиентов. Для этого к 900 куб. см мясо-пептонного бульона (п. 1.6.4.4) добавляют 5 г молочнокислого кальция, 5 г уксуснокислого натрия, 0,8 г солянокислого цистеина, 40 куб. см дрожжевого автолизата (п. 1.6.4.6) и 20 г агара. Смесь нагревают до температуры (95 +/- 2) °C, выдерживают при постоянном помешивании до расплавления агара и добавляют по 10 куб. см 0,01-процентных водных (на дистиллированной воде) свежеприготовленных растворов треххлористого железа и тетраборнокислого натрия, 10 куб. см 1-процентного раствора углекислого кислого натрия и 1 куб. см 0,4-процентного водного раствора индикатора нейтрального красного. С помощью 20-процентного водного раствора молочной кислоты устанавливают активную кислотность 5,7 +/- 0,05 ЕД pH. Приготовленную среду разливают в пробирки и стерилизуют при температуре (115 +/- 1) °C в течение 20 мин.

Примечание. Допускается при приготовлении питательной среды для определения спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий вместо мясо-пептонного бульона использовать основу, состоящую из гидролизата казеина и пептона. Для ее приготовления 10 г пептона добавляют к 1 куб. дм гидролизата казеина, устанавливают активную кислотность 5,7 +/- 0,1 ЕД pH, нагревают до кипения, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистые колбы. Стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

1.6.4.4. Приготовление мясо-пептонного бульона.

Мясо-пептонный бульон готовят следующим образом: говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, заливают двойным количеством питьевой воды, отмечают первоначальный объем и оставляют на (18 +/- 6) ч при температуре (5 +/- 1) °C. Для ускорения процесса выделения питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают при температуре (50 +/- 5) °C в течение (1,0 +/- 0,1) ч и затем кипятят (35 +/- 5) мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0 +/- 0,1)% пептона и (0,5 +/- 0,1)% хлористого натрия, устанавливают с помощью 1 н раствора гидроокиси натрия активную кислотность (7,3 +/- 0,1) ЕД pH. Приготовленный бульон разливают в колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

1.6.4.5. Приготовление водного агара.

В 1 куб. дм питьевой воды вносят 20 г мелко измельченного агара и нагревают до кипения. После растворения агара смесь в горячем состоянии фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки по 10 - 15 куб. см или в колбы по 50 - 100 куб. см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

1.6.4.6. Дрожжевой автолизат. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 куб. дм воды и помещают в термостат при 55 - 58 °C на 3 дня. После того помещают в автоклав и стерилизуют при 118 °C в течение 15 мин. Затем фильтруют, осадки промывают таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составляло 4 куб дм.

Фильтрат нейтрализуют 20-процентным раствором едкого натрия до pH 6,8, разливают в пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 мин.

1.6.5. Среда для обнаружения липолитических бактерий.

1.6.6. Среда для определения протеолитических бактерий (молочный агар).

Приготовляют 2-процентный водный агар и обезжиренное молоко. Обе среды стерилизуют отдельно при (121 +/- 1) °C в течение 10 мин.

При употреблении к расплавленному агару добавляют 20% обезжиренного молока и после тщательного перемешивания смесь выливают в чашки Петри.

1.6.7. Питательные среды для определения молочнокислых бактерий.

1.6.7.1. Стерильное молоко. Обезжиренное молоко (кислотность 16 - 18 °T) разливают в пробирки (1/3 часть их емкости) и затем стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин.

1.6.7.2. Гидролизованное молоко. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят и охлаждают до (45 +/- 1) °C. После установления активной кислотности 7,6 - 7,8 ед. pH к 1 куб. дм молока добавляют 0,5 - 1,0 г порошка панкреатина или 2 - 3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку (порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Затем к молоку добавляют 5 куб. см хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при 40 °C в течение 18 - 24 ч. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через 18 - 24 ч колбу вынимают из термостата, гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2 - 3 раза водой, устанавливают активную кислотность 7,0 - 7,2 ЕД pH и стерилизуют (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) °C.

1.6.7.3. Агар с гидролизованным молоком. К приготовленному гидролизованному молоку добавляют 1,5% агара. Смесь расплавляют при (121 +/- 1) °C (15 +/- 1) мин., фильтруют через вату (в теплом автоклаве), разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C (10 +/- 1) мин.

1.6.7.4. Капустный агар для определения молочнокислых бактерий в плодовоягодных наполнителях.

200 г размельченной свежей капусты добавляют в 1 куб. дм воды, смесь кипятят в течение (10 +/- 1) мин., фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученный фильтрат разводят в 2 раза водой, добавляют к нему 20 г глюкозы, 10 г пептона, 10 г углекислого кальция. Добавляют 15 - 20 г агара. Устанавливают активную кислотность среды 7,0 - 7,4 ЕД pH. Разливают в колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

1.6.8. Питательные среды для учета количества бифидобактерий.

Для учета количества клеток бифидобактерий используют кукурузно-лактозную и гидролизатно-лактозную среды.

1.6.8.1. Приготовление кукурузно-лактозной среды.

В небольшом количестве дистиллированной воды расплавляют агар в количестве (2,5 +/- 0,5) г на 1 куб. дм приготовляемой среды. К остальному количеству дистиллированной воды добавляют (10 +/- 1) г пептона, (40 +/- 1) куб. см водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного 1:6, (6 +/- 0,5) г натрия лимоннокислого трехзамещенного, (0,12 +/- 0,02) г магния сернокислого, (2 +/- 0,1) г калия фосфорнокислого однозамещенного, (1,0 +/- 0,1) г натрия фосфорнокислого двухзамещенного, смесь нагревают до температуры (80 +/- 2) °C, после чего соединяют с расплавленным агаром, добавляют (10 +/- 0,5) г лактозы и (0,15 +/- 0,05) г солянокислого цистина или (0,5 +/- 0,1) г кислоты аскорбиновой.

Цистин предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, в которой устанавливают активную кислотность среды (8,5 +/- 0,5) ЕД pH с помощью 10% раствора NaOH, и нагревают на водяной бане до полного его растворения.

Смесь доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и устанавливают активную кислотность среды (7,1 +/- 0,2) ЕД pH с помощью 40% раствора NaOH или 25% раствора аммиака. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по (10 +/- 0,5) куб. см и стерилизуют при (112 +/- 1) °C в течение (30 +/- 2) мин.

Среду проверяют на стерильность путем выдержки при температуре (37 +/- 1) °C в течение 2-х суток.

Хранят среду не более месяца при температуре (20 +/- 2) °C и не более 2-х месяцев при температуре (6 +/- 2) °C.

1.6.8.2. Приготовление гидролизатно-молочной среды.

Гидролизованное молоко, приготовленное по п. 1.6.7.2, разводят питьевой водой в соотношении 1:1.

В небольшом количестве разведенного гидролизата расплавляют агар в количестве (2,5 +/- 0,5) г на 1 куб. дм приготовляемой среды (в случае приготовления селективной среды с неомицином - (17 +/- 2) г агара на 1 куб. дм). К остальному количеству гидролизата добавляют (20 +/- 1) г пептона и (3,5 +/- 0,5) г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры (80 +/- 2) °C, после чего соединяют с расплавленным агаром. В смеси устанавливают pH 7,5 +/- 0,1, кипятят ее в течение (15 +/- 1) мин., дают отстояться, сливают с осадка не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее (10,0 +/- 0,5) г лактозы и (0,15 +/- 0,05) г солянокислого цистина. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по (10 +/- 0,5) куб. см и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °C в течение (30 +/- 1) мин. с предварительным подогревом автоклава паром в течение (30 +/- 2) мин., pH готовой среды 7,1 +/- 0,2. Проверка среды на стерильность и срок хранения по п. 1.6.8.1.

1.6.8.3. Приготовление селективных сред для определения количества бифидобактерий в продуктах, в микрофлоре которых присутствуют молочнокислые бактерии.

В составе кукурузно-лактозной (по п. 1.6.8.1) или гидролизатно-молочной среды (по п. 1.6.8.2) массовую долю агара увеличивают до (17 +/- 2) г на 1 куб. дм питательной среды. Среды разливают в пробирки по (20 +/- 0,5) куб. см и стерилизуют по п. 1.6.8.2.

Проверка сред на стерильность и срок хранения по п. 1.6.8.1.

При проведении анализа в готовые среды перед расплавлением вносят 0,1 куб. см раствора неомицина (приготовленного по п. 1.5.5) из расчета на 20 куб. см среды.

1.6.9. Среды для определения сульфитредуцирующих клостридий.

1.6.9.1. Приготовление дрожжевого экстракта жидкого.

100 г измельченных прессованных дрожжей заливают 500 куб. см дистиллированной воды, кипятят при постоянном перемешивании до тех пор, пока не сойдет пена, затем помещают на 24 ч при 4 - 6 °C в холодильник. Эмульсию фильтруют через вату, и фильтрат стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

1.6.9.2. Приготовление сульфитжелезной агаровой полужидкой среды.

К 100 куб. см мясо-пептонного бульона или 100 куб. см гидролизованного молока, приготовленного по п. 1.6.7.2, добавляют 1 г сухого дрожжевого экстракта или 5 куб. см жидкого дрожжевого экстракта, 0,6 - 0,7 г агара, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации его показатель составлял при 25 °C 7,1 +/- 0,1 ЕД pH. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

После стерилизации добавляют по 1 куб. см горячих (75 +/- 5) °C 5-процентных водных растворов сульфита натрия и лимоннокислого железа, стерилизованных или приготовленных в асептических условиях без стерилизации на стерильной дистиллированной воде. Допускается замена сульфита натрия на гипосульфит натрия в количестве 0,1 г на 100 куб. см среды, лимоннокислого железа - на хлорное железо в тех же концентрациях.

Среду перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 10 - 12 куб. см и используют для посева.

1.6.10. Качество вновь приготовленных питательных сред проверяют путем параллельного посева одних и тех же проб продукта на новую среду и на среду, на которой до этого проводилась работа. Качество вновь приготовленной среды считают удовлетворительным, если при подсчете количество выросших на ней колоний оказывается близким к количеству, полученному при использовании контрольной среды (среды, на которой проводилась работа ранее).

Результаты контроля записываются в журнал по форме.

1.6.11. Плотные питательные среды в холодильнике могут храниться до 3 месяцев, жидкие питательные среды - 10 - 14 дней.

Для проверки стерильности питательных сред их следует поставить в термостат при 37 °C на 48 ч. Если после этого на плотных питательных средах не обнаруживается колоний микроорганизмов, а в жидких средах нет помутнения среды или осадка, свидетельствующих о росте микроорганизмов, питательные среды считаются стерильными.

Для восстановления активности культуры 100 куб. см обезжиренного молока стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 - 15 мин. и охлаждают до 42 - 43 °C. Во флакон с сухой закваской добавляют 5 - 7 куб. см стерилизованного молока и тщательно перемешивают. Содержимое флакона вносят в молоко, подготовленное как указано выше, и перемешивают.

Заквашенное молоко термостатируют при указанной выше температуре в течение 12 - 18 ч до образования сгустка, после чего закваску охлаждают и используют для приготовления коллекционной тест-культуры.

Для приготовления коллекционной тест-культуры в пробирку с 10 куб. см стерильного обезжиренного молока вносят 1 петлю культуры и выдерживают в термостате при 42 - 43 °C в течение 16 - 18 ч. Коллекционную тест-культуру хранят при 6 - 8 °C и перевивают через 10 - 14 сут.

Через 3 - 4 пересадки культуры ее снова готовят из сухой культуры. Допускается использовать культуру дальше, если она не утратила своей активности и по микроскопическому препарату соответствует предъявленным требованиям.